人体胃肠道中栖身着大批微生物,构成极端繁杂的微生态系统,保持肠道稳态,在人体健壮中表现紧要影响[1-2]。肠道菌群参加大都口服药物的体内代谢,中药及其复方保守运用多为口服给药,不成防止地与肠道菌群互相来往,致使化学成份在肝脏首关效应以前产生代谢转折,药物的活性或*性产生显然改动,影响药效的表现[3-4]。另外,频年来大批协商阐明肠道菌群凌乱会致使肠道致病菌赶紧增殖,推进结肠炎、肥胖症、糖尿病及其并发症、血汗管疾病等多种疾病的产生进展[5-7]。因而可知,以肠道菌群为靶点的药物干涉将为疾病的提防及临床调节供给新的战术[8-9]。
*连为毛茛科多年生木本植物,临床上以其枯燥根茎入药,具备清热燥湿、泻火解*的成果,罕用于泻肚、糖尿病及其并发症等疾病的调节,临床疗效显著[10]。当代协商讲明,*连要紧含有小檗碱、*连碱、巴马汀等生物碱类活性成份,今朝唯一小量对于单体小檗碱的肠道菌群代谢协商[11],*连与肠道菌群的互相影响尚未见关系报导。而中药及其复方不时通过量组分、多关节、多靶点而实行对疾病的团体调治影响,于是开展*连索取物与肠道菌群的互相影响研讨,为*连体内代谢摄取及影响机制的深入协商供给科学根据。
1材料
1.1仪器与试剂
UPLC(Waters公司);Q-TOF-MS(Waters公司);高速离心术(上海安亭科学仪器厂);4种筛选性培植基:乳酸菌LBS琼脂培植基(编号HB)、双歧杆菌BS琼脂培植基(编号HB)、肠球菌培植基(编号HB)、伊红美兰培植基(编号HB)均购于青岛海博生物技能有限公司。
1.2药材
*连饮片(批号)购自安徽慧隆中药饮片有限公司,经南京中医药大学段金廒感化判定为CoptischinensisFranch。
1.3通俗厌氧培植基(GAM)
0.15g巯基乙酸钠、0.15gL-无水巯基丙氨酸盐酸盐、0.6g牛肉浸出粉、1.1g牛肉膏、1.25g磷酸二氢钾、1.5g大豆胨、1.5g葡萄糖、1.5g氯化钠、2.5g可溶性淀粉、2.5g酵母淀粉、5.0g卵白胨、5.0g朊卵白胨、6.15g消化血清、mL纯水。
2办法
2.1*连索取物的制备
称取*连适当,参与8倍量水,浸泡1h,煎煮30min,滤过,滤渣继承用6倍量水煎煮30min,滤过,归并2次滤液,滤液减压浓缩至生药品质浓度1.0g/mL,备用。经探测*连索取物中小檗碱、*连碱、巴马汀的品质分数别离为(.92±0.65)、(16.74±2.58)、(16.09±0.39)mg/g。
2.2肠道菌群的培植
汇集正凡人新鲜粪便5.0g,与生理盐水按比例1∶4比例混杂,涡旋2min,制成混悬液,r/min离心10min后,得上清液,即为肠道菌液。将肠道菌液用无菌生理盐水络续稀释,汲取0.1mL恰当的稀释液别离接种在响应的筛选性培植基平板上,平均涂布,并在37℃厌氧培植。别离停止肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的筛选性培植。将以上分散获得的百般细菌冷冻保管在4℃冰箱,备用。取0.1mL冷冻保管的健壮人肠道菌液至0.9mLGAM中,37℃厌氧培植24h,将活化后的菌液涡旋混匀,采纳无菌生理盐水稀释,调换菌液浓度为1×个/mL,备用。
2.3肠道细菌对*连索取物的转折及转折液的责罚
取0.1mL肠道菌群稀释液,参与到0.9mLGAM中,再参与0.1mL恰当品质浓度的*连索取物,以GAM培植液为比较组,37℃厌氧培植24h后,用1.5倍量的醋酸乙酯萃取,萃取液离心浓缩后,供UPLC-Q-TOF-MS解析。
2.4*连索取物对4种细菌成长的影响
取μL(浓度为1×个/mL)4种肠道菌液(乳酸菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌)别离参与到1.0mL含不同品质浓度(0.5、1.0、2.0g/mL)*连索取物的GAM培植液中,以不含药的菌悬液做为比较组,每组责罚反复3份,37℃厌氧培植,nm波长下测定其吸光度(A)值,直到细菌成长抵达稳按期。
2.5*连索取物转折先后的UPLC-Q-TOF-MS解析
2.5.1UPLC前提色谱柱为AcquityUPLCSyncronisC18(mm×2.1mm,1.7μm);崎岖相A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱:0~3min,80%~75%A;3~4min,75%~70%A;4~6min,70%~55%A;6~10min,55%~20%A;10~11min,20%A;11~12min,20%~80%A。体积流量0.4mL/min;柱温35℃;进样器温度4℃;进样量10μL;探测工夫12min。
2.5.2质谱前提ESI源;数据搜集形式和方法:MSE和Centroid,正离子形式;MS参数:离子源温度℃,脱溶剂温度℃,毛细管电压4.0kV,锥孔电压40V,脱溶剂气体积流量L/h,锥孔气体积流量50L/h;品质扫描范畴~m/z;采纳MetabolynxTM软件停止数据解析。
3了局
3.1*连索取物经肠道细菌代谢的UPLC-MS图谱解析
采纳UPLC-Q-TOF/MS测定*连索取物经肠道细菌的转折液,未转折及转折后*连索取物的总离子流图见图1,数据经MetabolynxTM软件解析后,肠道细菌对*连索取物的代谢产品见表1。通过对比孵育组和比较组总离子流图的保存工夫(tR)、相对分子品质及质谱断裂规律,了局讲明,孵育组含有未统统代谢的原形小檗碱、*连碱和通过肠道细菌代谢而造成的氢化小檗碱、氢化*连碱,特为是大批的小檗碱产生了氢化影响;另外,去甲氧基影响有助于抬高化合物的不乱性,如姜*素去甲氧基、去二甲氧基后,不乱性次第巩固,且tR值次第是去二甲氧基姜*素<去甲氧基姜*素<姜*素[12-13],故开始推断巴马汀经肠道细菌代谢为去甲氧基巴马汀(图2)。
3.2*连索取物对肠道菌群成长的影响
采纳浊度测定法查看不同品质浓度*连索取物对4类肠道细菌(肠杆菌、肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌)成长的影响,了局显示,*连索取物对病原菌如肠球菌和肠杆菌具备显著的压制影响,且压制影响随品质浓度抬高而巩固;对益生菌如双歧杆菌和乳酸菌具备显著的推进影响,且推进影响随品质浓度抬高而巩固(图3)。
4商议
4.1肠道菌群代谢影响影响中药药效
肠道细菌在成长通过中会造成水解酶、氧化复原酶、裂解酶、迁徙酶等多种百般的酶类,可停止水解、复原、甲基化、乙酰化、脱糖基等一系列生化反响,从而显著影响中药百般成份的体内摄取及生物活性[14]。如一些中药成份经肠道菌群代谢后造成前药而表现效应,麦冬皂苷D被大鼠肠道菌群代谢为薯蓣皂苷元,从而易于摄取入血[15];人参皂苷Rg3和Rh2通过肠道菌群的脱糖基影响,造成具备较强抗肿瘤活性的原人参二醇[16-17]。今朝胃肠道的首关效应已引发宽泛器重,开展肠道菌群对中药成份的代谢协商,阐释其在体内的代谢通过,有助于揭发中药药效物资基本。
*连的要紧活性成份为小檗碱、*连碱、巴马汀等生物碱类成份,但该类成份摄取差,血药浓度低,生物利费用低[18-19]。本协商发觉,*连生物碱类成份可被肠道菌群代谢为氢化小檗碱、氢化*连碱和去甲氧基巴马汀。小檗碱水溶性差,而其代谢产品氢化小檗碱的极性变大,脂水份派系数得以改进,易于摄取入血。朱志勇[20]在大鼠ig小檗碱后的尿液中发觉小檗碱氢化产品的硫酸连接型和葡萄糖醛酸连接型代谢产品,且又有协商讲明小檗碱的氢化产品与小檗碱共通表现药效[21];*连碱极难溶于水,大鼠ig*连碱后的血液中发觉氢化*连碱,且在尿液中发觉葡萄糖醛酸连接产品和硫酸酯化产品[22-23],而氢化*连碱具备调血脂、降血糖等影响[24];巴马汀去甲氧基反响后,其代谢物可与巴马汀共通表现药效[25]。因而可知,肠道菌群的代谢影响对于*连生物碱类成份的体内摄取及药效的表现起侧紧要影响,但参加*连代谢的特定细菌品种及其造成的酶系仍不领会,于是后续协商将加倍*连生物碱类成份代谢通过中肠道细菌种群机关与成效的协商,解析其代谢通过中何种细菌渗出何种酶参加哪些详细的代谢关节,从而有助于揭发肠道细菌转折*连化学成份的机制。
4.2肠道菌群大概成为中药表现效应的影响靶点
肠道为肠道菌群供给了优良的栖身与繁衍的处境,餍足其所需的百般生理前提,寻常的肠道菌群对宿主的消化、摄取、养分、代谢、免疫调治、抗苍老、生物拮抗等方面具备主动的生理影响[26]。频年来,越来越多的协商显示,人体肠道菌群凌乱与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病紧密关系[27-29]。协商发觉糖尿病患者体内产丁酸盐细菌丰采显著下落,而百般前提致病菌显然增添[30]。益生菌的程度大幅低落,无益菌程度大幅抬高,从而诱发浑身慢性低度炎症,巨噬细胞浸湿进一步干涉胰岛素记号的寻常转导,终究致使2型糖尿病及其并发症的产生进展。于是,基于肠道微生态协商将有助于揭发*连干涉糖尿病及其并发症的影响机制。本协商发觉,*连索取物可显然推进益生菌(乳酸菌、双歧杆菌)的成长,显著压制病原菌的成长,且调控影响与剂量呈正关系性。已有协商讲明,乳酸菌具备显然改进糖尿病模子大鼠的病理病症[31-32]。而肠道病原菌太过繁衍,造成大批内*素,使肠道通透性增添,致使肠源性内*素血症,终究引发多脏器成效枯竭[33-34]。因而可知,*连具备调控肠道菌群机关[35]、改进肠道微生态、推进肠道健壮的成效,希望实行灵验干涉糖尿病及其并发症等慢性疾病的产生进展。
参考文件(略)
起因:崔祥,陶金华,江曙,魏晓燕,徐君,钱大玮,段金廒.*连索取物与肠道菌群的互相影响协商[J].中草药,,49(9):-2.
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