本文摘自：《时珍国医国药》年第21卷第2期P-
基金项目：国家科技支撑计划项目(No.BAC18B04)；四川省科技厅应用基础资助项目(No.j13-)
作者介绍：张杰为四川大学教授，刘素君为乐山师范学院教授
摘要
目的：研究大蓟总*酮对肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用不同浓度的大蓟总*酮对人肝癌SMMC-和人子宫癌细胞Hela进行处理，MTT法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色观察凋亡小体。结果：大蓟总*酮对SMMC-的半数致死量(IC50)为93.64ug/ml；对Hela细胞的半数致死量(IC50)为85.12ug/ml。可见清晰的“梯子”状DNA带纹和凋亡小体。结论：大蓟总*酮能诱导癌细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。
大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物CirsiumjaponicumDC.的干燥地上部分或根[1]，多年生草本，高～cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5～6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦，归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿*、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有*酮、*酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为*酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用[2]。其总*酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能[3]。但总*酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，本文就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。
MTT法测试结果
用剂量12.5～ug/mg的大蓟总*酮处理SMMC-和Hela细胞48h后，MTT法测定大蓟*酮对癌细胞的抑制作用(见图1)。从图1可以看到，对SMMC-和Hela细胞的IC50分别93.64ug/ml和85.12ug/ml，同空白对照组比较差异极显著(P＜0.01)。当用剂量12.5～ug/mg的大蓟*酮处理SMMC-和Hela细胞1,2d或3d后，对肿瘤细胞的生长(见图2)，从图2可以看到，活细胞数随着大蓟*酮浓度的增加而减少。研究结果：表明大蓟*酮对SMMC-和Hela细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟*酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细胞的抑制效果就越明显。
图1Hela和SMMC细胞的活性检测
图2大蓟总*酮对Hela和SMMC细胞的抑制作用
A:大蓟总*酮对Hela细胞的作用(12.5,50,或ug/ml)
B:大蓟总*酮对SMMC细胞的作用(12.5,50,或ug/ml)，与阳性对照比较*P0.01
琼脂糖凝胶电泳结果
琼脂糖凝胶电泳结果见图3，从DNA电泳图(图3)上可以看到，癌细胞经ul/ml的大蓟总*酮处理培养72h后，出现大小约为～bp整数倍的DNA梯形断裂条带，而空白对照组细胞DNA提取物经琼脂糖凝胶电泳后只检测到一条总DNA条带。Hela细胞用ul/ml的大蓟*酮处理培养72h后，出现大小约为～bp整数倍的DNA梯形断裂条带(图3-A)。lane3为阳性对照(Hela细胞用0.1uMtaxol处理4h(图3-A)。图3大蓟总*酮对SMMC的电泳图。癌细胞经ul/ml的大蓟总*酮处理培养72h后，同样出现大小约为～bp整数倍的DNA梯形断裂条带(图3-B,lane4)。研究结果表明：大蓟*酮能诱导SMMC-和Hela细胞凋亡。
图3大蓟总*酮诱导Hela和SMMC-细胞凋亡的影响
A（左）:用AE-CJ处理后的Hela细胞条带
1.bpDNAMarker2.为阴性对照3.为0.1uMTaxol处理后的DNA(阳性对照)4.用ul/ml大蓟总*酮处理72h的DNA
B（右）:用AE-CJ处理后的SMMC-细胞条带
1.bpladder2.为阴性对照3.为0.1uMTaxol处理后的DNA(阳性对照)4.ul/ml大蓟总*酮处理72h的DNA
DAPI染色观察肿瘤细胞凋亡的特征
凋亡的另一个特征是用DAPI染色观察染色体DNA的形态，图4(A)为未处理的Hela细胞染色体DNA，图4(B)是用大蓟总*酮ul/ml处理24h后的Hela细胞染色体DNA。Hela细胞在空白对照中出现分散的染色体DNA，图3(A)，而用药物处理后Hela细胞的染色体DNA明显的随处理时问而改变，24h后，染色体DNA在核膜附近浓缩成一个或几个明显的小体，图4(B)。图4(C～D)为处理和未被处理的SMMC细胞染色体DNA形态的变化，其凋亡特征也能观察到。
图4DAPI染色的Hela和SMMC-细胞
A:未用药物的Hela细胞；B:用ul/ml大蓟总*酮处理后的Hela细胞；C:未用药物的SMMC细胞；D:用ul/ml大蓟总*酮处理后的SMMC细胞
讨论
细胞凋亡是人体保持某一细胞群生存与死亡平衡的生理机制。它参与调节机体的发育、细胞的分化，体内正常细胞的更新和异常细胞的清除。普遍认为它与分裂、细胞分化类似，是一个级连式(Cascade)基因表达的结果，受许多因素的调控[4]。如果这一调控发生异常则会导致包括肿瘤、自身免疫病、神经系统疾病以及AIDS等许多疾病的发生。细胞凋亡的典型特征是：细胞凋亡过程中，被激活的核酸内切酶可有规律地将凋亡细胞DNA在两核小体间切断，DNA凝胶电泳时形成了特征性的DNA阶梯。形态上则表现为染色质固缩为不均一点状结构。细胞凋亡的另一显著特征是凋亡过程中交联细胞蛋白酶(transglutaminant)等的信号途径被激活，致使细胞浆浓缩形成的具有完整细胞膜包裹的凋亡小体(Apobody)，电镜下，表现为凋亡发生早期，凋亡小体内含有正常形态的线粒体等细胞器[5]。
大蓟总*酮能诱导人肝癌SMMC-细胞和人子宫癌Hela细胞的凋亡，通过MTT法检测，其对Hela细胞的IC50为85.12ug/ml，对SMMC-细胞的IC50为93.64ug/ml。大蓟总*酮诱导细胞凋亡，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状或颗粒状，与凋亡形态学改变相对应的生化学基础是细胞核小体连接处DNA被随机切成～bp左右及其倍数的寡核苷片段，琼脂糖凝胶电泳可见典型的“梯形”带，大蓟总*酮处理SMMC-和Hela细胞后，相差显微镜下观察，细胞体积缩小，核裂解，细胞出泡，形成凋亡小体(图4)，细胞贴壁能力下降，逐渐从培养瓶壁上脱落下来，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状，DNA电泳可见典型的“梯形”带(图3A、B)。说明SMMC-和Hela细胞经大蓟总*酮处理后发生了凋亡特征性改变。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典,I部[S].北京:化学工业出版社,4:18.
[2]MitsuoMiyazawa,ChikakoYamafuji,KohsukeKurose,etal.Volatile
